옹스트롬

Nature 617권, 711~716페이지(2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

분자 특이성을 지닌 형광 현미경은 복잡한 생물학적 시스템을 이해하기 위해 생명과학에서 사용되는 주요 특성화 방법 중 하나입니다. 초고해상도 접근법1,2,3,4,5,6은 15~20nm 범위의 세포 분해능을 달성할 수 있지만 개별 생체분자 간의 상호 작용은 10nm 미만의 길이 규모에서 발생하며 분자 내 구조의 특성화에는 Ångström 분해능이 필요합니다. 최첨단 초해상도 구현7,8,9,10,11,12,13,14은 특정 시험관 내 조건에서 5nm까지의 공간 분해능과 1nm의 위치 정밀도를 보여주었습니다. 그러나 이러한 해상도는 세포 실험으로 직접 변환되지 않으며 Ångström 해상도는 현재까지 입증되지 않았습니다. 여기에서는 기성 형광 현미경 하드웨어 및 시약을 사용하여 형광 현미경의 해상도를 Ångström 규모까지 향상시키는 순차 이미징(RESI)에 의한 해상도 향상인 DNA 바코드 방법을 소개합니다. >15 nm의 적당한 공간 해상도에서 희박한 표적 하위 집합을 순차적으로 이미징함으로써 우리는 전체 손상되지 않은 세포의 생체 분자에 대해 단일 단백질 해상도를 달성할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 우리는 Ångström 해상도를 사용하여 DNA 종이접기에서 단일 염기의 DNA 백본 거리를 실험적으로 해결합니다. 우리는 원리 증명 시연에서 우리의 방법을 사용하여 치료되지 않은 세포와 약물 치료된 세포에서 면역 요법 표적 CD20의 분자 배열을 현장에서 매핑하여 표적 면역 요법의 분자 메커니즘을 평가할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 관찰은 RESI가 온전한 세포의 주변 조건에서 분자 내 이미징을 가능하게 함으로써 초고해상도 현미경과 구조 생물학 연구 사이의 격차를 줄이고 복잡한 생물학적 시스템을 이해하는 데 핵심적인 정보를 제공한다는 것을 보여줍니다.

광시야 단일 분자 국소화 현미경(SMLM)15에서 표적 분자의 국소화 정밀도(σSMLM)는 궁극적으로 그리고 근본적으로 깜박임 이벤트당 수집된 광자(N)의 수에 의해 제한됩니다. \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\about \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF는 광학 센서의 PSF(점 확산 함수)의 sd입니다. 이미징 시스템16, 그림 1a). 동일한 대상(그림 1b, 상단)의 여러 위치 파악은 유한한 정밀도로 인해 실제 위치 주위에 분산됩니다. SMLM으로 해결할 수 없는 두 개 이상의 지점은 지역화의 중복 분포를 생성하므로 각 대상에 대한 지역화의 고유한 할당이 불가능합니다(그림 1b, 하단). 그러나 각 위치가 색상, 바코드 또는 기타 분자 ID를 통해 특정 표적에 할당될 수 있는 경우 표적별로 명확하게 그룹화될 수 있습니다2.

a, SMLM에서 단일 염료의 σSMLM은 \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\)로 확장되어 궁극적으로 달성 가능한 공간 해상도를 제한합니다. b, DNA-PAINT와 같은 SMLM 접근 방식은 약 10 nm 공간 분해능을 특징으로 합니다(해상도는 최대 반치에서 전폭으로 대략 2.35 σSMLM). 따라서 20 nm(d1)로 분리된 표적은 일상적으로 확인할 수 있는 반면, 2 nm 간격(d2)으로 떨어진 물체는 결과적인 위치 분포가 겹치기 때문에 확인할 수 없습니다. c, Exchange-PAINT에서와 같이 직교 DNA 서열(파란색 및 녹색)과 순차적 획득을 사용하여 SMLM 분해능 한계보다 더 가깝게 간격을 둔 대상의 위치를 ​​각 대상에 대해 명확하게 할당할 수 있습니다. d, 각 이미징 라운드에 대해 대상당 모든 위치(K)를 결합하면 위치 지정 정밀도가 sd(σSMLM)에서 sem(σRESI)으로 향상됩니다. e, 초고해상도가 형광 현미경에 혁명을 일으켰듯이, RESI는 초해상도 데이터에 위치 파악 개념을 다시 적용하여 또 다른 패러다임 전환을 가져왔습니다. f, RESI의 현지화 정밀도는 \(\frac{1}{\sqrt{K}}\)로 확장되므로 RESI의 해상도 개선은 σSMLM과 무관하여 Ångström 스케일의 현지화 정밀도에 도달합니다.